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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷碱化绘制组学、LC-MS/MS磷碱化位点研究技术服务。
英文字母主题：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
繁体中文子标题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
企业客户企业：山东大学
深入分析的材料：拟南芥侧根
拜谱提供了的技术：磷碱化突显组学、LC-MS/MS磷碱化位点进行分析
研究方案想法：
PART 01 探究最终结果
01、的生长素增强VIK的磷过酸以至于转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷酸性反应淀粉酶质多组分析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 发芽素催进VIK的磷过酸和其转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷酸性反应试验。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过发酵粉双混种研究（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补式三维成像实验室（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且体内磷酸性反应实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。公交实时降钙素原检测PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素走势积极进取调空 LR 健康发育
按照分析一下的两个VIK T-DNA插进甲基化体（vik-2和vik-3），会发现与野山型相比之下，甲基化体的LR溶解度、LR原基（LRP）和已骨骼健康植物生长的LR重要削减，更是是vik-2（图2）。相悖，过呈现VIK的转表观遗传茎叶具体表现出LR溶解度增强。再者，在vik-2甲基化体游戏 背景下呈现VIK的转表观遗传茎叶恢复过来了LR骨骼健康植物生长瑕疵。衍生素外理实验操作取决于，vik-2甲基化体对衍生素引诱的LR骨骼健康植物生长症状减退，取决于VIK在衍生素管控LR骨骼健康植物生长中发挥出来重点功用。 
图2 VIK介导的生长的素网络信号环路同向控制LR的成长发育
03、VIK 与ERF13 开始高中物理人机交互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双团伙荧光互替 （BiFC）和免役共乳浊液实验性（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13上下级效应
04、VIK以双面馈的方式政策调控ERF13磷碱化
通过磷酸性反应核蛋白组学数据分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点基因变异挖掘显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正负极馈玩法磷过酸ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷过酸有助于ERF13分解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体外实验设计设计和体內实验设计设计，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸仿真和磷酸降解变异体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚細胞手机定位浅析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷硝化作用减速了ERF13化学降解
06、VIK 介导的 ERF13 磷过酸控制 LR 的诞生
探析进步讨论了VIK自我调节的ERF13吸附在侧根（LR）骨骼发育中的用。凭借会较为有差异 转基因水稻遗传植被系的LR表型，看到过描述ERF13缓和了LR的发现，在vik转变体中此类缓和用增进，而在过描述YFP-VIK的原型下此类缓和用弱化（图6）。前者，会较为ERF13的有差异 磷碱化模仿训练和磷酸灭活突变体的过描述植被系，看到ERF132A-Myc（磷酸灭活）的植被系LR发现更短，而ERF132D-Myc（磷碱化模仿训练）的植被系LR发现略多。这么多結果发现，VIK介导的ERF13磷碱化和吸附利于了LR的发现。 
图6 VIK介导的ERF13磷过酸加速LR的经常出现
07、VIK在侧根成长中磷酸性反应并保持稳定LBD18核蛋白
借助进行分析好几个VIK T-DNA嵌入变化体（vik-2和vik-3），看到与原生态型相较于，变化体的侧根（LR）体积黏度、LR原基（LRP）和已发肓的LR重要减小，尤其是是vik-2（图7）。反过来，过把你想把你想表达出来出来VIK的转表观遗传茎秆现象出LR体积黏度增高。然而，在vik-2变化体背景图下把你想把你想表达出来出来VIK的转表观遗传茎秆还原了LR发肓障碍。发展素补救科学试验证明，vik-2变化体对发展素诱惑的LR发肓不起用弱化，证明VIK在发展素管控LR发肓中发挥出来关键的用。 
图7 VIK 在LR建立全过程中一直磷碱化和增强LBD18蛋清
PART 02 散文个人心得体会
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷过酸蛋清质组学剖析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的发芽素数字信号调理侧根变成
PART 03 拜谱个人总结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的高蛋白酶质组学、绘制高蛋白酶质组学、代谢率组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—超多深浅DIA·磷硝化作用突显组，采用创新聚集新技术+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现爬行动物模板10w+、藤本植物模板5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
分类文献：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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